2.1 전자현미경의 분해능

전자의 파장은 가속전압(acceleration voltage)의 평방근에 반비례하여 짧아지므로, 높은 가속전압을 사용하면 매우 짧은 파장의 전자를 만들어 낼 수 있다(Table 2). 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)의 경우 30 kV가 최대 가속전압이고, 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM)의 경우 기본적으로 30 kV 이상의 가속전압을 사용하므로 가속전압의 측면으로만 봤을 때 TEM이 SEM 보다 높은 분해능의 이미지를 제공할 수 있음을 알 수 있다.

가속전압이 높으면 분해능은 향상되지만, 높은 전자 에너지로 인해 시료가 분해되는 현상이 발생한다. 탄소나노튜브나 실리콘 결정의 경우 100 kV로 가속하여도 시료에 손상이 가지는 않지만, 200 kV로 가속하면 이미징이 불가능하다. 하지만 탄소나노튜브나 실리콘 결정에 수소원자나 낮은 원자번호가 섞인 시료의 경우에는 100 kV 이하에서도 손상이 발생할 수 있다.⁶⁾ 셀룰로오스는 C, O, H로 이루어진 고분자이므로 100 kV 이상의 가속전압을 사용하는 경우 시료가 쉽게 분해될 것으로 예상된다. 따라서 나노셀룰로오스의 고분해능 이미지를 얻기 위해서는 낮은 가속전압(60 kV 또는 80 kV)을 선택하는 것이 필요하다. 낮아진 가속전압으로 인한 분해능 저하는 수차보정 장치를 이용하여 분해능을 높여 보정이 10^-1 nm 수준의 분해능에 도달하는 것이 가능하다.⁷⁾

2.2 전자-물질 상호작용

전자현미경은 전자를 광원으로 사용하므로, 전자가 시료 표면에 도달하게 되면 전자와 물질 사이에 여러가지 물리적인 현상이 발생한다. 이러한 상호작용을 전자-물질 상호작용이라고 하며, 전자-물질 상호작용으로 인해 다양한 신호가 동시다발적으로 발생한다. 이러한 신호에는 일차전자 또는 후방산란전자(backscattered electron, BSE), 이차전자(secondary electron, SE), 특성 X선(characteristic X-ray), 오제전자(Auger electron), 음극발광(cathodeluminescence)이 있다(Fig. 2a). 일차전자는 입사된 전자가 시료의 물질을 구성하는 원자와 직접적으로 충돌을 일으키지 않고 다시 시료 밖으로 나온 전자를 말한다. 다른 원자와 물리적인 충돌은 발생하지 않았지만, 원자 사이를 통과하면서 에너지가 낮아지게 된다(Fig. 2b). BSE는 상호작용하는 원자의 번호에 따라 신호의 강도가 달라지기 때문에 이종원소가 섞여있는 재료를 분석하는 경우 유용하게 사용할 수 있다. 또한 높은 에너지로 인해 충전(charging)현상의 영향을 적게 받는다.

SE는 입사된 전자로 인해 시료 밖으로 튕겨져 나온 시료의 구성 원자의 전자를 말한다. SE의 에너지(50 eV 이하)는 입사전자, BSE에 비해 매우 낮은 상태이며(Fig. 3), 이렇게 낮은 에너지를 가진 SE가 시료에서 빠져 나올 수 있는 깊이에는 한계가 있다. SE는 시료의 표면으로 부터 약 5~50 nm 깊이까지 방출이 가능하며(Fig. 2a), 이러한 특성으로 인해 SEM에서 표면형상을 관찰하는데 이용된다.

높은 에너지를 가지는 입사전자와 시료의 원자간의 상호작용으로 인해 발생하는 X선에는 연속 X선(continuous X-ray)과 특성 X선(characteristic X-ray)이 있다. 특성 X선이 원자별로 고유한 에너지 값을 가진다는 사실을 이용하여, 전자현미경으로 관찰하는 영역의 원소 조성을 분석해 낼 수 있는 분석방법을 에너지분산분광법(Energy Dispersive Spectrometer, EDS)이라고 한다. EDS를 이용하면 시료를 만들 때 사용한 원소들의 분포를 알 수 있다.

오제전자는 오제효과(Auger effect)에 의해 발생되는 전자를 말하는데, 원자나 이온에서 이차전자가 방출되고 나면 높은 준위의 전자가 빈자리를 채우게 되고, 준위 차이만큼의 에너지가 발생한다(Fig. 2b). 이 에너지가 광자의 형태로 방출되거나 두 번째 전자를 추가로 방출하는데 사용될 수 있는데, 이렇게 두 번째로 발생되는 전자를 오제전자라고 한다. 따라서 오제전자의 에너지는 BSE의 에너지 영역에 포함되지만(Fig. 3), SE에 의한 이차적인 효과이므로 오제전자가 검출될 수 있는 시료 깊이는 표면으로 부터 1 nm 이하이다.

음극발광은 고에너지의 전자가 물질에 에너지를 공급하고, 여기(excited)된 물질로 부터 특정한 파장의 빛이 발생되는 현상을 말한다. 모든 물질이 음극발광을 하는 것이 아니므로, 음극발광 성질이 있는 물질이 섞여 있는 경우 이를 구분해 내는데 사용된다.

Fig. 2.

Interaction volume and various signals caused by electron and matter interaction. a) interaction volume and detectable depth of electrons, b) generation of secondary, backscattered, and Auger electrons.

Fig. 3.

Electron energy distribution of secondary, backscattered, and Auger electrons.

3.1 주사전자현미경

SEM을 이용하면 수십 밀리미터에서 수십 나노미터 크기의 시료로부터 고분해능 이미지를 획득할 수 있다. 분해능 측면에서 TEM이 SEM 보다 나은 성능을 보이지만 시료 준비나 관찰영역 측면에서는 SEM을 이용하는 것이 장점이 더 많다.

SEM은 전자총의 종류에 따라 실질적으로 이용할 수 있는 최고 분해능과 배율이 달라진다. 일반적인 텅스텐 필라멘트를 사용하는 SEM보다 FEG(Field Emission Gun)를 사용하는 FESEM(Field Emission Scanning Electron Microscope)을 사용하게 되면 100,000배 이상의 고배율의 이미지를 얻는 것이 더 수월해진다. 이러한 FESEM의 장점은 FEG에서 방출되는 전자의 밀도가 높으며 전자간 에너지 분산정도가 작기 때문이다(Table 3). FESEM에서는 이러한 전자를 이용하여 매우 낮은 수준의 가속전압을 사용하여도 고품질의 이미지를 얻을 수 있게된다. 요즘의 FESEM에서는 30 kV에서는 0.4 nm, 1 kV에서는 1 nm 수준의 분해능을 보여준다.

나노셀룰로오스와 같이 나노미터 길이 수준의 형태를 제대로 관찰하기 위해서는 가능한 낮은 가속전압을 사용하여야 한다. SEM에서 가속전압이 낮아지면 분해능이 저하되는데, FESEM의 경우에는 1 kV에서도 1 nm 수준의 분해능을 보여주므로 수십 나노미터의 나노셀룰로오스 물질을 이미지를 획득하는 것이 가능하다. 낮은 가속전압을 사용하면 얻을 수 있는 또 하나의 장점은 전도성 코팅이 없는 시료의 검경이 가능하다는 것이다.

SEM 이미징에서 사용되는 검출기에는 전자렌즈 외부에 위치하는 외부검출기(external detector)와 전자렌즈 안쪽에 위치하는 내부검출기(internal detector; in-lens detector)가 있다. 이차전자 검출기의 경우 내부검출기가 외부검출기 보다 명확한 고해상도 이미지를 획득하는데 유리하다. 이는 입사전자(incident electron)과 상호작용이 발생한 시료의 위치에 가장 근접한 위치에서 발생한 이차전자(SE1)만이 내부검출기에 도달하기 때문이다. 반면 외부검출기는 입사전자가 입사위치에서 발생하는 이차전자(SE1)뿐만이 아니라 입사위치에서 떨어진 위치에서 방출된 이차전자(SE2), 챔버나 전자렌즈의 물질에서 방출되는 이차전자(SE3), BSE, X선이 챔버, 전자렌즈 등에 입사되어 방출된 이차전자와 외부검출기 방향으로 진행하는 BSE가 함께 검출되어 신호가 오염되기 쉽다(Fig. 5).

Fig. 5.

a) Various secondary electrons (SE1, SE2, and SE3), backscattered electrons (BSE), and X-ray, b) SE1 concentrated at the incident position.

전자현미경용 시료준비 방법은 최초의 시료가 건조된 상태인지 젖은 상태인지에 따라 달라지며, 젖은 시료의 경우에는 대부분 건조과정을 거쳐야 한다(Fig. 6). 건조과정은 시료에서 수분을 제거하는 과정이며, 시료 내부의 수분이 제거되면서 수축이 발생하므로 시료의 형태가 변하며, 심한 경우 구조가 파괴되는 경우가 발생하므로 주의깊게 진행해야 할 필요가 있다.

Fig. 6.

Various sample preparation pathways for electron microscopy.

나노셀룰로오스의 건조 방법으로 고온건조(oven dry-ing, OD)법⁸⁾, 분무건조 (spary drying, SD)법⁹⁾, 동결건조(freeze drying, FD)법^10,11), 임계점건조(critical point drying, CPD, or supercritical drying, SCD)법⁸⁾, 스프레이(spray drying, SD)법¹²⁾을 적용할 수 있다(Table 4). 건조방법에 따라 나노셀룰로오스의 집적을 방지하기 위해 메탄올, 에탄올, 아세톤과 같은 휘발성이 높은 용매와 치환하는 방법을 함께 이용할 수 있다. 건조 방법은 관찰목적에 따라 달리 선택하는 것이 좋은데 나노셀룰로오스의 입자 형태만 관찰할 것인가 젖은 상태의 나노셀룰로오스의 구조를 관찰할 것인가에 따라 달라진다. 나노셀룰로오스가 겔(gel) 상태일때의 구조를 관찰하려면 FD법이나 SCD법을 이용하여야 한다.

SEM을 이용하여 나노셀룰로오스를 검경하는 경우에는 충전(charging) 현상으로 인한 문제를 피하기 위해 코팅을 해야하는 경우가 많다. 충전현상은 부도체 물질을 검경할 때 자주 발생하는 문제로 입사된 전자가 빠져 나가지 못하고 시료에 갇혀 새로 입사되는 전자를 밀어내는 현상이 발생한다. 따라서 시료에 입사된 전자가 흘러 나갈 수 있도록 금속막이나 탄소막으로 코팅을 한다.

코팅에서 사용되는 전도성 재료의 선택에도 주의가 필요한데, 전도성 코팅에서 많이 사용되는 금(Au)의 경우에는 코팅층의 금 입자의 크기가 커서 고배율에서는 사용하지 않는 것이 좋다. 백금(platinum)이나 탄소의 입자가 더 작으므로 금보다 적합한 코팅 재료이다. 하지만 충분한 전도성을 나타내기 위한 두께와 코팅막의 균질성까지 고려한다면 오스뮴(Os)을 사용하는 것도 고려해볼 필요가 있다.

나노셀룰로오스의 직경이 수십 나노미터 이하이므로 2~10 nm 두께의 전도성 코팅막은 실제 직경보다 큰 값을 얻게되는 원인이 된다. 따라서 나노셀룰로오스의 직경 측정이 필요한 경우에는 전도성 코팅을 하지 않는 것이 좋으나, 코팅을 해야 한다면 가능한 얇게 하는 것이 좋다. 나노셀룰로오스 시료를 평활한 전도성 물질 위에 부착시키고, 낮은 가속전압(<= 1 kV)과 시료표면과 렌즈하단 사이의 거리(working distance, WD)를 매우 작게(<= ~2 mm) 유지하면 코팅하지 않은 나노셀룰로오스 시료에서 충전 현상없이 고분해능 사진을 획득할 수 있다.

MCC, MFC는 시료의 크기가 큰 편이므로 SEM의 종류에 상관없이 적절한 품질의 사진을 얻을 수 있다. 하지만, NFC, CNC와 같이 한 방향의 크기가 나노미터 수준으로 작아지게 되면 고배율 이미징시 전자에 의해 발생하는 열로 인해 시료가 손상될 수 있다. 또한 입사전자의 에너지가 높을 수록 전자의 침투깊이가 커져서 시료대에서 발생한 신호가 많이 발생한다. 이로 인해 최종적으로 얻게되는 현미경 사진의 화질이 저하된다. 따라서 입사전자의 에너지를 낮추어야 시료의 손상을 최소화하면서도 나노셀룰로오스 시료에서 나온 신호의 비율이 높은 현미경 사진을 획득할 수 있다. 이러한 측면에서 텅스텐 필라멘트를 사용하는 SEM보다 FEG를 사용하는 FESEM을 사용하는 것이 좋다.

Figure 7의 오른편의 이미지는 왼편의 마이크로미터 크기의 섬유에서 생산된 NFC의 이미지이다. 일반 SEM으로 수 나노미터의 분해능을 가지는 사진을 찍으려면 10 kV 이상의 가속전압을 사용해야 하는데, 이런 경우 입사전자가 NFC를 투과할 확률이 높아진다. 전자가 시료를 투과하게 되면 시료 표면의 세밀한 구조를 관찰할 수 없게 된다. 또한 높은 가속전압은 전자의 에너지를 높여 시료에 많은 열이 발생하게 되어, 시료가 쉽게 손상된다.

Fig. 7.

Micrographs by field emission scanning electron microscope (FESEM): on the left side commercial cellulose starting materials: softwood sulfite pulp fibers (a), wheat straw pulp fibers (b), refined fibrillar-fibrous wheat straw pulp (c), refined beech wood pulp powder (d), and refined fibrillar-fibrous beech wood pulp (e). On the right side mechanically, laboratory isolated nanofibrillated cellulose out of the stated starting materials.²⁶⁾

FESEM에서는 2 kV 이하의 가속전압을 사용하기가 용이하며, 1 kV 이하의 가속전압으로도 1 nm 수준의 분해능을 보이는 시스템을 사용한다면 나노셀룰로오스의 손상을 최소화하면서 고배율의 이미지를 획득할 수 있다. Figure 8에서 볼 수 있는 세밀한 표면구조는 코팅하지 않은 NFC 시료를 낮은 가속전압을 이용하여 사진을 찍을 수 있었기 때문에 가능한 것이다.

Fig. 8.

High-resolution FESEM surface images of NFC films by different treatments. The images were acquired at 50,000 from areas without a conductive gold layer.¹⁵⁾

하지만 기존 연구에서 주사전자현미경의 이미징 조건을 명확하게 표시한 경우는 많지 않다. 가속전압, 작업거리(working distance, WD)를 명확학게 표시한 경우는 많지 않고, 대부분 사용한 현미경의 모델명과 가속전압만을 표시하였다(Table 5). 사용된 가속전압도 10 ~ 15 kV 수준이며, 시료에 코팅을 한 상태로 이미징을 하였기 때문에 전체적인 형태를 관찰하는데에는 사용할 수 있으나 나노셀룰로오스 피브릴의 직경을 측정하는데에는 부정확한 결과를 얻을 가능성이 있다.

3.2 투과전자현미경

CNC과 같은 결정상의 나노셀룰로오스 입자는 주로 TEM을 이용하여 형태적인 특징을 관찰한다. TEM은 주로 60-300 kV 정도의 가속전압을 사용하기 때문에 일반적으로 0.1-0.2 nm 수준의 분해능을 가지는 이미지를 획득할 수 있다. 하지만, 나노셀룰로오스와 같은 고분자나 생물 시료를 TEM으로 찍으려고 할 때에는 고에너지를 가지는 전자로 인한 시료의 손상이 쉽게 발생하기 때문에 TEM의 최고 분해능을 보여주는 사진을 획득하기는 매우 어렵다. 또한 시료와 배경 사이의 대비(contrast)가 낮아서 나노입자의 형태를 명확하게 관찰하기 어렵다.

나노셀룰로오스 입자가 고르게 분산되어 있는 TEM 사진이 형태 관찰과 길이 측정에 유리하기 때문에 적절한 숫자의 입자가 잘 분산되어 있는 사진을 얻기 위해서는 적절한 지지막을 선택하는 것도 매우 중요한 일이다. 그리드 위의 지지막으로 탄소막, 포름바막, 탄소+포름바막이 널리 사용된다. 사용된 지지막의 종류에 따라 나노셀룰로오스 입자의 분산 상태, 염색의 품질이 영향을 받기 때문에 나노셀룰로오스 물질의 종류나 처리 상태에 따라 적절한 지지막의 선택과 표면처리를 적용하는 것이 필요하다. 탄소 지지막은 소수성을 띄기때문에 친수성 표면을 가지는 나노셀룰로오스가 잘 부착되지 않는 경향이 있다.

시료의 안정성과 대비를 향상시키기 위해서 염색법을 적용한다. TEM을 이용한 나노셀룰로오스 이미징에 가장 일반적으로 사용되는 음성염색법(negative stain-ing)은 탄소막이나 포름바(formvar)막이 있는 TEM 그리드 위에 시료를 부착시킨 후 주변을 UA(uranyl ace-tate)나 PTA(Phosphotungstic acetate)로 염색하는 방법이다(Fig. 9).

Fig. 9.

Illustrated procedure of negative staining method for TEM.

음성염색법으로 준비된 시료에서 획득한 이미지는 NFC나 CNC의 주변이 어둡게 나타나 실제 관찰하려는 부분은 상대적으로 밝게 나타난다(Fig. 10)²⁰⁾. 음성염색법을 적용하여 획득한 이미지는 간접적으로 나노셀룰로오스를 확인하는 방법이므로 염색법을 적용하는 과정에서 여러가지 문제가 생길 수 있다. UA나 PTA의 상태에 따라 염색의 품질이 영향을 받기때문에 염색액에 침전물이 생겼는지 반드시 확인할 필요가 있다. 또한 시료대로 사용되는 그리드의 탄소막은 소수성이기 때문에 표면이 친수성을 띄는 나노셀룰로오스가 탄소막에 잘 부착되지 않는다. 이러한 부착 문제는 Glow discharge로 어느 정도 완화될 수 있지만 완벽한 해결책은 아니다.

Fig. 10.

TEM micrographs of negatively stained cellulose whiskers obtained by sulfuric acid hydrolysis of cotton (a), Avicel (b), and tunicate (c-e) cellulose. Insets: enlarged views of some characteristics particles. The arrows in (d) indicate zones where the whiskers are seen edge-on.¹⁴⁾

염색액의 품질이나 부착 문제에 대한 대안으로 동결투과전자현미경(cryo-TEM)을 이용할 수 있다. Cryo-TEM을 이용하기 위해서는 시료를 순간적으로 유리화(vitrification) 할 수 있는 장치와 이렇게 처리한 동결시료를 영하의 저온을 유지한 상태로 옮길 수 있는 장치가 필요하다. 동결시에 얼음결정이 생기지 않도록 희석한 나노셀룰로오스 물질을 액화에탄(liquid ethane)과 액화프로판(liquid propane)을 1:1로 혼합한 용액과 혼합한 후, 미량을 섭씨 -180도에 순간적으로 노출시켜 얼음결정 없이 유리화 시키는 방법을 사용한다(Fig 11).

Fig. 11.

Cryo-TEM micrograph of cellulose particles embedded invitreous ice: (a) cotton, (b) tunicin. The arrows point to regions of the whiskers that are seen edge-on and generate a stronger diffraction contrast. ¹⁴⁾

염색을 하지 않은 시료를 이미징할 수 있는 또 다른 대안으로 EFTEM(energy-filtered transmission elec-tron microscopy)이 있다. 염색을 하지 않은 상태에서 이미징이 불가능한 이유 중에 하나는 나노셀룰로오스와 배경 사이의 대비가 거의 없기 때문이다. 하지만 에너지필터가 장착된 TEM을 사용한다면, 20-30 eV의 에너지를 가지는 bulk plasmon 전자(Fig. 3)를 검출하여 염색하지 않은 상태에서도 나노셀룰로오스의 존재를 확인할 수 있다(Fig. 12).

Fig. 12.

Cellulose nanofibril imaging by energy- filtered transmission electron microscope (EFTEM). a) Brightfield image, and b) Plasmon imaging at 24 eV.²⁷⁾

이와 같이 투과전자현미경 검경에 있어서 그리드, 지지막, 표면처리, 염색법은 나노셀룰로오스의 분포에 영향을 주므로 연구결과를 제시할 때 함께 제시하는 것이 가장 좋다. 하지만 실제로 모든 논문에서 정확한 정보를 제공하는 것은 아니다(Table 6).

3.3 정량화

나노셀룰로오스 나노결정(CNC)의 직경과 길이는 가장 기초적인 형태적 특성이므로 이를 정확하게 측정하는 것은 중요한 일이며, CNC의 직경 및 길이 측정을 위해서 주로 사용되는 현미경은 TEM이다(Table 7). TEM으로 부터 획득한 고분해능, 고배율의 이미지는 CNC의 형상을 정량화하는데 필요한 요건을 갖추고 있다. 하지만, 더 정확한 길이 측정을 위해서는 사용된 TEM 기술과 시료 준비시 이용된 염색법에 의한 영향을 반드시 고려하여야 한다.

음성염색법을 사용하는 경우 간접적으로 CNC를 관찰하게 되므로 실제 길이와는 다른 값을 얻게 될 가능성이 있으며, 또한 시료를 건조하는 과정에서 응집이 발생할 수 있다. 염색에 의한 문제와 건조 중 응집 문제는 동결TEM법을 이용하면 해결이 가능하다. 음성염색법과 동결TEM을 적용하여 CNC의 직경을 비교한 연구²⁰⁾의 결과를 살펴보면, 직경을 6 nm으로 가정하여 시행한 시뮬레이션의 결과와 동결TEM에서 측정한 결과는 매우 유사한 직경 분포를 보였다. 음성염색법을 이용한 CNC의 직경분포는 동결TEM의 결과와는 다른 양상을 보였다(Fig. 13). 따라서 음성염색법으로 CNC의 직경을 측정하는 것 보다는 동결TEM법을 사용하여 측정하면 더 정확한 측정결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

Fig. 13.

(a) Width distribution of hydrolyzed cotton cellulose Cot45 determined from TEM images of negatively stained preparations; (b) width distribution calculated from the projection of 6 nm thick objects free-rotating around thir long axis and having the width distribution shown in (a); (c) width distribution of Cot45 particles determined from cryo-TEM images.¹⁴⁾

TEM을 이용해서 특정 시료의 대표적인 크기를 결정하기 위해서는 통계적으로 충분한 수의 나노셀룰로오스 입자의 크기를 측정하여야 하는데, TEM에서 사용하는 그리드 위에 올려지는 양이 시료 전체에 비해 매우 적은 양이다. 여기에 나노셀룰로오스 입자를 제대로 확인하기 위해서는 최소 수만배 이상의 배율이 요구된다. 배율이 높아질 수록 관찰 영역은 더 작아지므로 TEM에서 실제로 관찰하는 나노셀룰로오스 입자의 수는 더욱 적어진다. 이러한 상황에서 TEM을 통해 측정된 나노셀룰로오스의 크기가 대표성을 가지기 위해서는 나노셀룰로오스 입자가 용매 안에 균일하게 분산되어 있어야 하며, 균질하게 분산된 나노셀룰로오스 입자가 그리드 위에서도 균일하게 분산되어 있어야 한다.

용매 내에서 나노입자의 크기 분포와 분산의 안정성은 광산란법(dynamic light scattering, DLS)으로 확인이 가능하다. DLS법은 간접적으로 크기를 측정하지만 측정 대상이 되는 나노셀룰로오스 입자의 양은 통계적으로 대표성을 띌 만큼 충분하다. 하지만 대상 입자의 형태를 직접 관찰할 수 없으므로 나노셀룰로오스와 같이 길이대 직경비가 큰 물질의 경우에는 측정결과가 실제 크기와 차이가 크게 날 수 있다. 하지만, 입자의 분산 상태와 처리 효과에 따른 입자의 크기 및 분산 상태 변화를 분석하는 데에는 필수적인 분석방법이다.

구형의 나노입자 크기 측정에 있어서 DLS법의 특성상 TEM과 같은 직접적인 크기 측정법에 비해 측정결과가 크게 나오는 경향이 있다. 반대로 TEM은 건조와 염색법에 의한 영향으로 크기 측정결과가 실제 크기보다 작게 나오는 경향이 있다. 따라서 DLS법과 TEM의 측정결과에서 입자의 평균 크기, 분산 정도, 분산의 안정성, 입자의 방향별 크기(직경, 길이) 등의 요소를 함께 고려하여 나노셀룰로오스의 대표 크기와 오차 수준을 결정하는 것이 좋다²⁸⁾.