1. 서 론
나노셀룰로오스(nanocellulose)는 친환경적이고 지속가능한 소재로 각광받고 있으며, 다양한 분야에서 활용되고 있다. 특히 높은 비강도를 나타내기 때문에 복합재료의 재질을 조절할 수 있는 첨가원료로 주목받고 있다. 나노셀룰로오스는 생산 방식에 따라 박테리아 셀룰로오스(baterial cellulose, BC), 셀룰로오스 나노결정(cellulose nanocrystal, CNC), 셀룰로오스 나노피브릴(cellulose nanofibril, CNF)로 나눌 수 있다.1)
BC는 글루코스를 양분으로 삼는 미생물을 사용하여 생합성 된다. 순도가 가장 높다는 장점을 가지고 있으며 이로 인해 의료, 미용 분야로의 적용 연구들이 다양하게 진행되고 있다. BC는 인장강도가 높다는 장점이 있지만, 대량 생산 시 미생물에서 기원하는 단백질 잔류로 인한 생물학적 오염이 발생할 수 있다. 또한 생합성 기간이 길고 생산설비용량 대비 수율이 낮아 CNF, CNC를 제조할 때에 비해 생산성이 떨어진다.2) 침상의 형태를 갖는 CNC는 나노셀룰로오스 중 강도적 성질이 가장 강하며, 높은 결정화도로 인해 복합재료의 강도적 성질을 개선하기 위한 첨가제로 주목받고 있다. 하지만 CNC는 진한 황산 또는 염산을 이용한 가수분해 공정을 통해 생산되기 때문에 생산 후 폐산의 재처리가 어렵고 내산성 설비가 요구되어 초기 설비비용 및 설비 유지비용이 크다는 단점이 있다. CNF는 CNC와 비교할 때 낮은 결정화도로 인해 강도가 낮게 나타나지만 생산 설비가 간단한 편이다. 콜로이드밀(colloidal mill), 고압균질기(high pressure homogenizer), 마이크로플루이다이져(microfluidizer) 등과 같은 설비를 통해 생산하며 생산 시 발생하는 동력 비용이 크다는 문제점이 있었지만 최근 다양한 전처리 연구들을 통해 이러한 문제들을 극복하기 위한 노력이 투입되고 있다.3-7)
CNF는 생산 방식 및 전처리 정도에 따라 종횡비의 차이가 크게 나타나며 이로 인해 CNF를 포함하는 복합재료의 물성에 커다란 영향을 미치게 된다. 따라서 CNF의 형태적 특징을 규명하는 것은 CNF가 포함된 물질의 재질 발현 기작을 이해하기 위해 반드시 필요하다. 형태적 특징을 파악하기 위해 입도분석기와 같은 여러 종류의 분광분석기기를 사용하는 연구들이 진행되었으나, 나노스케일의 형태적 특징을 규명하는 것에 한계가 있다.8)
나노물질의 형태적 특징을 확인하는데 전자현미경이 많이 이용된다. 하지만 나노셀룰로오스와 같은 유기물은 전자빔에 비교적 강한 무기물을 이미징 할 때와 동일한 전자빔 조건에서는 시료의 손상이 쉽게 나타날 수 있다. 이 경우 정확한 형태적 특징 규명이 불가능하므로 유기물인 나노셀룰로오스의 이미징에 적합한 전자현미경 조건을 찾는 것이 필요하다.9)
전자현미경은 이미징 원리에 따라 크게 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM), 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM)으로 나눌 수 있으며, 재료적 특징에 맞게 분석에 사용할 전자현미경의 종류를 선정하여야 한다. SEM을 이용하면 표면에 분산되어 있는 나노셀룰로오스의 고배율 이미지를 얻을 수 있으나, 시료대 위에 떨구어진 나노셀룰로오스의 현탁액의 건조 과정에서 나노셀룰로오스 간에 자가 결합으로 인해 뭉치게 되므로 개별 나노셀룰로오스의 크기 측정이 매우 어렵다. 또한 SEM으로 부도체 시료를 이미징하는 경우 전도성물질 코팅이 필요한데 CNF의 경우 코팅을 하게 되면 코팅층의 두께로 인해 나노셀룰로오스의 폭을 정확하게 측정할 수 없다.10-12)
TEM을 이용하여 CNF를 이미징하는 경우 그리드 위에 시료가 적절하게 분산되어 있어야 하며, 충분한 대비를 보일 수 있도록 이미지의 대비를 향상 시킬 수 있는 처리가 필요하다. 전처리 과정에서 현탁액 상의 CNF를 바로 TEM 그리드의 지지막 위에 떨군 후 건조하므로 개별 CNF의 이미지를 얻기가 용이하지만 건조 과정 중의 뭉침 현상은 유사하게 발생하므로 CNF의 크기를 정성적, 정량적으로 분석하기 위해서는 시료입자가 지지막 위에 균일하게 분산되도록 조절할 필요가 있다.13-16) 일반적으로 그리드의 지지막으로 포름바막, 비정질 탄소막이 있으며 재료의 특성으로 인해 소수성을 나타낸다. 소수성이 강한 지지막의 경우 글로우디스차지(glow discharge)와 같이 지지막을 친수성화 하는 처리가 필요하다. Silicon monoxide막의 경우 친수성을 가지며 따라서 소수성 지지막에 비해 나노셀룰로오스의 분산이 좋게 나타난다.17-18) 이와 같이 지지막의 종류에 따라 시료의 고정과 분산이 달라지므로 개별 나노셀룰로오스 입자의 형태를 정확하게 파악하는데 적절한 지지막의 선택이 중요하다.
염색하지 않은 나노셀룰로오스의 TEM 이미지는 대비가 낮기 때문에 시료의 형태를 정확하게 측정하기 어렵다. 따라서 대비를 높이는 염색법이 사용되는데 나노셀룰로오스 이미징에 사용되는 염색방법은 주로 음성염색법(negative staining)이다. 음성염색법은 시료 자체가 아닌 시료의 주변을 염색하는 방법으로, 염색제로 인해 시료의 주변은 어둡고 시료 자체는 밝게 나타도록 하는 방법이다.19) 많은 연구가 음성염색법을 이용하여 나노셀룰로오스의 형태를 나노미터 수준의 분해능을 가지는 사진을 획득하였으며, 이를 이용하여 형태를 정량화하는데 사용되어왔다. 음성염색법을 사용하는 경우 TEM 그리드 지지막의 종류뿐만이 아니라 현탁액의 pH도 나노셀룰로오스의 분산에 영향을 미치는 중요한 인자이므로 모두 고려하여야 CNF가 최적의 분산을 보일 수 있다.20)
본 연구에서는 지지막의 종류와 pH에 따른 셀룰로오스 나노피브릴의 분산성의 차이와 그로 인한 투과전자현미경 이미지 품질의 차이를 확인하고자 하였다. 이를 위해 pH 3.5, 5.0 조건에서 formvar, carbon, silicon monoxide 지지막에 분산된 나노셀룰로오스의 투과전자현미경 이미지를 비교한 결과를 보고하고자 한다.
2. 재료 및 방법
2.1 공시재료
분석에 사용되는 CNF는 M사에서 제공받은 혼합 활엽수 표백크라프트 펄프로부터 제조하여 사용하였다. 그리드의 지지막은 formvar, carbon, silicon monoxide 3종을 사용하였다. 제조사에서 명시한 그리드 사양은 Table 1과 같다.
2.2 실험방법
2.2.1 CNF 제조
활엽수 표백 크라프트 펄프를 원료로 CNF를 생산하기 전 생산성 향상을 위하여 카르복시 메틸화(carboxymethylation) 처리를 진행하였다. 2 L의 이소프로필알코올에 펄프 75 g를 해리 후 40.5 g의 가성소다를 용해시킨 메탄올 400 mL와 클로로아세트산 50 g을 용해시킨 이소프로필알코올 600 mL를 추가 투입하여 95°C에서 2.5시간 동안 반응하였다. 처리 후 세척과정을 거쳐 잔류 성분을 제거 하였다.
카르복시메틸화 처리된 펄프는 1%(w/w oven dry pulp) 농도로 희석 후 콜로이드 밀(IKA process-pilot 2000/4, IKA, Germany)을 이용하여 그라인딩을 실시하였다. 그라인더의 갭 사이즈는 0.104 mm, 그라인더 회전 속도 12,000 rpm 조건으로 30분간 처리하였다.
2.2.2 투과전자현미경 관찰
나노셀룰로오스가 최적의 분산을 보이는 지지막 및 처리방법을 시험하기 위하여 formvar, carbon, silicon monoxide 지지막이 적용된 3종의 그리드를 이용하여 투과전자현미경 촬영용 샘플을 제작하였다. 각각의 그리드는 친수성 시료인 CNF 입자의 분산성 정도를 pH 조건에 따라 확인하기 위해 pH 3.5, 5.0 두 가지로 나누었다. 나노셀룰로오스 현탁액에 pH 조건에 맞추어 미량의 HCl를 첨가하여 제조하였다. 그리드는 4분간 15 mA에서 glow discharge 처리된 그리드와 처리하지 않은 그리드를 각각 준비하였다. 생산된 셀룰로오스 나노피브릴 입자간 상호작용을 최소화하기 위해 0.001%로 희석 하였고, 각 그리드 위에 올린 후 UA를 사용하여 음성염색을 실시하였다. 모든 과정을 거친 후 가속전압 120 kV 조건으로 TEM(Libra120, Carl Zeiss, Germany) 촬영하였으며 각 샘플은 20만배 배율에서 촬영하여 비교하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 pH와 그리드 지지막 종류에 따른 CNF의 분산 차이
3종의 지지막의 주요 특성은 Table 2와 같으며 이를 통해 친수성인 셀룰로오스 나노피브릴을 샘플로 사용할 때의 분산성과 고정 정도를 예측할 수 있다.
Table 2
Properties of support film
| Support film | Hydrophilic | Thermostability | Electron transparent |
|---|---|---|---|
| Formvar | - | - | - |
| Carbon | - | + | + |
| Silicon monoxide | ++ | + | + |
pH를 3.5와 5.0으로 조절하여 분산성을 비교하였을 때 formvar, carbon, silicon monoxide 모두 pH 3.5 조건에서 분산성이 높게 나타났다(Table 3). Formvar 지지막은 그 표면이 소수성을 띄어 CNF 입자들이 고정되기 어려우며 고정이 되어도 CNF 섬유가 다발 형태로 뭉치는 것을 확인하였다(Fig. 1). 또한 다른 재질과 달리 formvar 지지막을 사용한 그리드는 pH 5.0 조건에서는 전혀 고정되지 않아 TEM 촬영이 불가능하였다.
Table 3
Degree of dispersion by the supporting film of TEM grid and pH of suspension
| Support film type | pH 3.5 | pH 5.0 | pH 7.0 | |
|---|---|---|---|---|
| Control | Formvar | - | - | - |
| Carbon | + | + | + | |
| Silicon monoxide | +++ | ++ | + | |
| Glow discharge treatment | Formvar | - | - | - |
| Carbon | ++ | + | + | |
| Silicon monoxide | +++ | ++ | ++ |
Fig. 1
TEM image of cellulose nanofibril after glow discharge treatment on formvar support film grid (pH 3.5 condition).
Carbon 지지막을 사용하여 pH 조건을 3.5로 조절한 경우 완벽한 입자 간 분산이 이루어지지 않았지만 개별 입자를 확인할 수 있는 수준의 분산성을 나타냈다(Fig. 2). 반면 pH 5.0 조건에서는 formvar 지지막이 적용된 그리드보다 좋은 분산성을 나타내었지만 입자 특성을 규명할 수 있는 수준의 분산성을 보이지 못했다(Fig. 3).
Fig. 2
TEM image of cellulose nanofibril after glow discharge treatment on carbon support film grid (pH 3.5 condition).
Fig. 3
TEM image of cellulose nanofibril after glow discharge treatment on carbon support film grid (pH 5.0 condition).
Silicon monoxide는 사용된 지지막 중 친수성이 가장 높으며, 친수성을 나타내는 CNF 입자들이 가장 고르게 분산되어 고정됨을 확인할 수 있었다. pH 3.5 조건에서는 입자의 분산성이 매우 뛰어 입자 특성을 확인하기 용이함을 알 수 있었다(Fig. 4). pH 5.0 조건에서도 다른 지지막을 사용하는 경우와 비교하여 좋은 분산성을 나타냈다(Fig. 5). 이를 통해 셀룰로오스 나노피브릴의 TEM 촬영을 위해서는 지지막의 친수성이 높은 재질을 적용한 그리드를 이용하여 입자를 고정시키는 것이 필요하다는 것을 확인할 수 있었다.
3.2 Glow discharge 처리에 따른 분산성 변화
Glow discharge 처리는 친수성 물질의 TEM 촬영 시 carbon, formvar와 같은 소수성 지지막을 한시적으로 친수성화 시켜 샘플의 고정을 용이하게 하기 위해 사용되는 기법이다.17-18) 지지막의 종류에 따라 glow discharge 처리 효과가 달라지며, 해당 처리를 통한 분산성 향상 정도를 확인하기 위하여 3종의 그리드를 glow discharge 처리 전 후 TEM 촬영에 적용하였다. Fig. 2와 Fig. 6을 통해 carbon 지지막에 glow discharge 후 분산성이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 formvar 지지막은 glow discharge 하지 않은 경우 모든 조건에서 셀룰로오스 나노피브릴의 고정이 이루어지지 않아 TEM 촬영이 불가능하였으며, glow discharge 처리 후 pH 3.5 조건에서도 매우 낮은 분산성을 나타내어 TEM 촬영에 적합하지 않은 지지막임을 확인하였다(Fig. 1).
Silicon monoxide 지지막 자체가 친수성으로 소수성 지지막을 일시적으로 친수성화 시키는 glow discharge의 여부에 따른 분산효과는 뚜렷하게 나타나지 않았다(Figs. 4 and 7).
4. 결 론
투과전자현미경을 이용하여 나노셀룰로오스의 형태적 특징을 규명하기 위해서는 개별 입자가 잘 분산되도록 준비하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 CNF의 형태적 특징을 규명하기 위한 투과전자현미경 시료 준비 조건을 그리드 지지막의 종류(formvar, carbon, silicon mon-oxide), glow discharge 여부 및 pH 변화에 따른 CNF 입자의 분산을 비교하였다.
CNF는 가장 높은 친수성을 나타내는 silicon monoxide 지지막이 적용된 그리드를 사용할 때 시료 고정이 유리하였으며, formvar 지지막이 적용된 그리드에서의 시료 고정이 가장 곤란하였다.
Glow discharge 처리를 통한 친수성 나노셀룰로오스 샘플의 고정 향상은 기존 지지막의 특성에 따라 효과가 달라졌으며, 친수성이 높은 silicon monoxide 지지막의 경우 그 효과가 미비하였다. 하지만 소수성을 나타내는 carbon 지지막의 경우 glow discharge를 통한 분산성 향상이 뚜렷하게 나타났다.
CNF 표면을 소수성으로 개질하는 경우, 본 연구의 친수성 기반 TEM 촬영 조건과 다른 조건이 설정되어야 한다. 이 경우 위의 결과와 반대로 친수성이 제한되는 조건일수록 더 좋은 분산성을 나타낼 것으로 예상된다.
